Tehnologia de producere a insulinei

Profilaxie

Insulina este unul dintre hormonii produși chiar de corpul uman, în special pancreasul. Încălcarea secreției acestei substanțe duce la apariția unei astfel de boli grave ca diabetul. Pentru tratamentul său, folosind un hormon sintetic, care de mult timp izolat din pancreasul animalelor. Cu toate acestea, tehnologia de producere a insulinei cu ajutorul unei bacterii foarte frecvente - Escherichia coli sau ciuperca de drojdie a fost folosită de foarte mult timp. Utilizarea acestei metode vă permite să evitați reacțiile alergice cauzate de proteina străină, care are o mică diferență față de cea umană.

Schema tehnologică

Tehnologia de producție a insulinei include toate etapele principale ale producției de produse biotehnologice. Rezultatul este un produs final cristalin, care este apoi utilizat pentru a prepara soluții injectabile utilizate în tratamentul diabetului zaharat sever de tip I și II. Efectul principal al acestui hormon în organism se manifestă prin scăderea nivelului de glucoză conținut în sânge.

Etapele producției de insulină vor fi următoarele:

Preliminar. Ea efectuează operațiuni precum prepararea și purificarea apei și a aerului, curățarea spațiilor industriale și sterilizarea echipamentelor, inspecția personalului, prelucrarea mâinilor și eliberarea de pantofi și îmbrăcăminte sterile. De asemenea, la etapa preliminară se realizează sinteza chimică primară a lanțurilor moleculare din care se asamblează proteina. Lanțul A conține 21 de resturi de aminoacizi, iar lanțul B conține 30 de aminoacizi.
Prepararea soluțiilor nutritive și culturilor celulare. Pentru a face o celula vii sa produca compusul necesar, se introduce gena corespunzatoare. Pentru aceasta, plasmida este tăiată de enzime speciale, restrictazele, iar genele care codifică sinteza compușilor necesari sunt cusute în ea. Apoi, folosind o metodă de microinjecție, plasmida modificată este returnată în celulă.
Cultivarea suspensiei celulare. Celulele modificate genetic sunt plasate într-o soluție nutritivă, având toate ingredientele necesare pentru creștere și reproducere și supuse sterilizării. Cultivarea culturii are loc în bioreactoare speciale, unde este alimentat aerul pre-purificat. Periodic, o anumită cantitate de soluție nutritivă este adăugată în reactor și în același timp este retras același volum de suspensie celulară.
Alocarea culturii. Separarea fluidelor și a culturilor celulare se efectuează prin sedimentare (sedimentare) în sedimente speciale și apoi prin filtrare, care permite păstrarea integrității celulelor.
Curățarea cromatografică a substanței. Se efectuează pe echipamentul adecvat, folosind diverse metode, în special cromatografia frontală, schimbătoare de anioni și gel permeabil.
Obținerea moleculei de proteine. În stadiul actual de biotehnologie, apare sinteza unei molecule de insulină neproducată. Și cele două componente ale lanțurilor sale. Acestea sunt cusute după oxidarea și plierea lanțurilor obținute, rezultând formarea de punți disulfidice.
Liofilizarea într-un cuptor special, după care preparatul cristalin rezultat este verificat pentru conformitatea cu standardul, ambalat, etichetat și expediat consumatorului.

Compania noastra in conditii avantajoase ofera linii de productie gata, in care toate tehnologiile de producere a insulinei sunt respectate pe deplin. Datorită calculelor precise, suportului tehnic și informativ, precum și instruirii personalului în cadrul unui program cuprinzător, compania va fi profitabilă și produsele sale vor fi în cerere.

Tipuri de insulină și metode pentru producerea acesteia

1. Tipuri de insulină

2. Obținerea de insulină

Insulina (din insula latină, insulă) este un hormon peptidic care se formează în celulele beta ale insulelor pancreatice din Langerhans. Ea are un efect multilateral asupra metabolismului în aproape toate țesuturile.

Principala funcție a insulinei este de a asigura permeabilitatea membranelor celulare pentru moleculele de glucoză. Într-o formă simplificată, putem spune că nu numai carbohidrații, ci și eventualii nutrienți sunt în cele din urmă împărțiți în glucoză, care este folosită pentru a sintetiza alte molecule care conțin carbon și este singurul tip de combustibil pentru centralele celulare - mitocondriile. Fără insulină, permeabilitatea membranei celulare la glucoză scade de 20 de ori, iar celulele mor din cauza foametei, iar zahărul în exces dizolvat în sânge otrăvește corpul.

Insuficiența secreției de insulină datorată distrugerii celulelor beta - deficit de insulină absolută - este un element-cheie în patogeneza diabetului zaharat de tip 1. Încălcarea efectului insulinei asupra deficienței de insulină a țesutului - are un loc important în dezvoltarea diabetului de tip 2.

Istoria descoperirii insulinei este asociată cu numele medicului rus I.M. Sobolev (a doua jumătate a secolului al XIX-lea), care a demonstrat că nivelul zahărului din sângele uman este reglementat de un hormon special al pancreasului.

În 1922, insulina izolată din pancreasul unui animal a fost introdusă inițial pentru un băiat diabetic de zece ani. rezultatul a depășit toate așteptările, iar un an mai târziu, compania americană Eli Lilly a lansat primul preparat de insulină animală.

După primirea primului lot industrial de insulină în următorii câțiva ani, a fost parcurs un mod uriaș de izolare și purificare. Ca rezultat, hormonul a devenit disponibil pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 1.

În 1935, cercetătorul danez Hagedorn a optimizat acțiunea insulinei în organism prin propunerea unui medicament prelungit.

Primele cristale de insulină au fost obținute în 1952, iar în 1954 biochimistul englez G.Senger a descifrat structura insulinei. Dezvoltarea metodelor de purificare a hormonului de la alte substanțe hormonale și produse de degradare a insulinei a făcut posibilă obținerea unei insuline omogene, denumită insulină mono-componentă.

La începutul anilor 70 gg. Oamenii de știință sovietici A. Yudaev și S. Shvachkin au propus sinteza chimică a insulinei, însă implementarea acestei sinteze pe scară industrială a fost costisitoare și neprofitabilă.

În viitor, a existat o îmbunătățire progresivă a gradului de purificare a insulinei, ceea ce a redus problemele cauzate de alergii la insulină, afectarea funcției renale, afectarea vizuală și rezistența la insulină imună. Cel mai eficient hormon a fost necesar pentru terapia de substituție în diabetul zaharat - insulina omologă, adică insulina umană.

În anii '80, progresele în biologia moleculară au făcut posibilă sintetizarea lanțurilor de insulină umană folosind E.coli, care au fost apoi legate într-o moleculă de hormon biologic activ, iar insulina recombinantă a fost obținută la Institutul de Chimie Bioorganică al Academiei Ruse de Științe folosind E.coli.

Utilizarea cromatografiei de afinitate a redus în mod semnificativ conținutul de proteine contaminante din preparat cu o greutate moleculară mai mare decât insulina. Astfel de proteine includ proinsulină și proinsuline parțial clivate, care sunt capabile să inducă producerea de anticorpi antiinzulinici.

Utilizarea insulinei umane de la începutul terapiei minimizează apariția reacțiilor alergice. Insulina umană este absorbită mai rapid și, indiferent de forma medicamentului, are o durată mai scurtă de acțiune decât cea a insulinei animale. Insulinele umane sunt mai puțin imunogeni decât carnea de porc, în special insulinele bovine și porcine amestecate.

1. Tipuri de insulină

Preparatele de insulină diferă în funcție de gradul de purificare; sursa de primire (bovine, porcine, om); substanțe adăugate la soluția de insulină (prelungirea acțiunii sale, bacteriostatice etc.); concentrare; Valoarea pH-ului; posibilitatea de a amesteca ICD cu SDI.

Preparatele pe bază de insulină variază în funcție de sursă. Porcul și insulina bovină diferă de compoziția de aminoacizi umane: bovină în trei aminoacizi și porcină într-una. Nu este surprinzător faptul că, în tratamentul cu insulină bovină, reacțiile adverse se dezvoltă mult mai frecvent decât în tratamentul cu insulină umană porcină sau umană. Aceste reacții sunt exprimate în rezistență imunologică la insulină, alergie la insulină, lipodistrofie (modificarea grăsimii subcutanate la locul injectării).

În ciuda dezavantajelor evidente ale insulinei bovine, ea este încă utilizată pe scară largă în lume. Și totuși, din punct de vedere imunologic, deficiențele insulinei bovine sunt evidente: în niciun caz nu este recomandat să se prescrie la pacienții cu diabet zaharat nou diagnosticat, femeile însărcinate sau pentru terapia cu insulină pe termen scurt, de exemplu, în perioada perioperatorie. Calitățile negative ale insulinei bovine sunt, de asemenea, conservate atunci când sunt utilizate într-un amestec cu porcine, astfel încât insulinele mixte (porcine și bovine) să nu fie utilizate, de asemenea, pentru tratamentul acestor categorii de pacienți.

Preparatele de insulină umană pentru structura chimică sunt complet identice cu insulina umană.

Principala problemă a metodei biosintetice de obținere a insulinei umane este purificarea completă a produsului final din cele mai mici impurități ale microorganismelor utilizate și ale produselor lor metabolice. Noile metode de control al calității asigură că insulinele biosintetice umane ale producătorilor de mai sus sunt libere de orice impurități nocive; astfel, gradul de purificare și eficiența scăderii glucozei îndeplinesc cele mai înalte cerințe și sunt aproape la fel. Orice efecte secundare nedorite, în funcție de impurități, aceste medicamente nu au insulină.

În prezent, trei tipuri de insuline sunt utilizate în practica medicală:

- cu rază scurtă de acțiune, cu debut rapid de efect;

- durata medie a acțiunii;

- acționează pe termen lung cu efect lent.

Tabelul 1. Caracteristicile preparatelor comerciale de insulină

Insulina cu acțiune scurtă (ICD) - insulină regulată - este o insulină cristalină cu durată scurtă de acțiune care este solubilă la pH neutru, efectul căruia se dezvoltă în 15 minute după administrarea subcutanată și durează 5-7 ore.

Prima insulină prelungită (SDI) a fost creată la sfârșitul anilor 30, astfel încât pacienții să poată face injecții mai puțin frecvent decât atunci când utilizau ICD singur, dacă este posibil o dată pe zi. Pentru a crește durata acțiunii, toate celelalte preparate de insulină sunt modificate și, când sunt dizolvate într-un mediu neutru, formează o suspensie. Acestea conțin protamină în tampon fosfat - protamin zinc-insulină și NPH (protamin Hagedorn neutru) - insulină NPH sau concentrații diferite de zinc în tampon acetat - insulină ultralente, bandă, șaptetile.

Produsele pe bază de insulină pe termen mediu conțin protamină, care este o proteină de m medie. 4400, bogat în arginină și derivat din lapte de păstrăv curcubeu. Pentru formarea complexului este necesar un raport de protamină și insulină 1:10. după administrarea subcutanată, enzimele proteolitice distrug protamina, permițând absorbția insulinei.

NPH-insulina nu modifică profilul farmacocinetic al insulinei regulate amestecate cu aceasta. NPH-insulina este preferabilă ca bandă de insulină ca o componentă a duratei medii de acțiune în amestecurile terapeutice care conțin insulină regulată.

În tamponul fosfat, toate insulinele formează cu ușurință cristale cu zinc, dar numai cristalele de insulină bovină sunt suficient de hidrofobe pentru a asigura eliberarea lentă și constantă a insulinei caracteristice ultralente. Cristalele de zinc ale insulinei porcine se dizolvă mai repede, efectul apare mai devreme, durata acțiunii este mai scurtă. Prin urmare, nu există nici un ultralente medicament care să conțină numai insulină porcină. Monocomponentul de insulină porcină este produs sub denumirea de suspensie de insulină, insulină neutră, insulină izofan, insulină aminoquinuridă.

Banda de insulină este un amestec de insulină 30% din semilantul (precipitatul de insulină amorfă cu ioni de zinc în tampon acetat, efectul căruia se disipează relativ repede) cu 70% din insulina ultralente (insulină cristalin zinc insuficient solubilă, care are un debut întârziat și o acțiune prelungită). Aceste două componente oferă o combinație cu o absorbție relativ rapidă și o acțiune stabilă pe termen lung, făcând banda de insulină un agent terapeutic convenabil.

2. Obținerea de insulină

Insulina umană poate fi produsă în patru moduri:

1) sinteza chimică completă;

2) extracția din pancreasul unei persoane (ambele metode nu sunt adecvate din cauza ineficienței: dezvoltarea insuficientă a primei metode și lipsa materiilor prime pentru producția de masă prin a doua metodă);

3) printr-o metodă semisintetică utilizând o substituție chimică enzimatică la poziția 30 a catenei B a alaninei aminoacide în insulina de porc cu treonină;

4) metoda biosintetică pentru tehnologia ingineriei genetice. Ultimele două metode permit obținerea de insulină umană de înaltă puritate.

În prezent, insulina umană se obține în principal în două moduri: prin modificarea insulinei de porc printr-o metodă sintetică-enzimatică și printr-o metodă de inginerie genetică.

Insulina a fost prima proteină obținută în scopuri comerciale utilizând tehnologia ADN recombinant. Există două abordări principale pentru obținerea de insulină umană modificată genetic.

În primul caz, separat (diferitele tulpini producătoare) produce ambele lanțuri urmate de plierea moleculei (formarea de punți disulfidice) și separarea izoformelor.

În al doilea, preparatul sub formă de precursor (proinsulină) urmat de scindarea enzimatică cu tripsină și carboxipeptidază B în forma activă a hormonului. Cea mai preferată în prezent este obținerea de insulină ca precursor, asigurând închiderea corectă a punților disulfidice (în cazul producerii separate a lanțurilor, se efectuează cicluri succesive de denaturare, separarea izoformelor și renaturarea).

În ambele abordări, este posibil atât obținerea individuală a componentelor de pornire (lanțuri A și B sau proinsulină), cât și ca parte a proteinelor hibride. În plus față de lanțurile A și B sau proinsulină, pot fi prezente în compoziția proteinelor hibride:

- protector purtător, care asigură transportul proteinei hibride în spațiul periplasmic al celulei sau al mediului de cultură;

- afinitate, facilitând în mare măsură selectarea unei proteine hibride.

În același timp, ambele componente pot fi prezente simultan în compoziția proteinei hibride. În plus, atunci când se creează proteine hibride, poate fi utilizat principiul multidimensionalității (adică mai multe copii ale polipeptidei țintă sunt prezente în proteina hibridă), ceea ce face posibilă creșterea semnificativă a randamentului produsului țintă.

În Marea Britanie, ambele lanțuri de insulină umană au fost sintetizate utilizând E.coli, care au fost apoi legate la o moleculă de hormon biologic activ. Pentru ca un organism unicelular să sintetizeze moleculele de insulină pe ribozomii săi, este necesar să îi furnizeze programul necesar, adică să introducă gena hormonală.

Obțineți din punct de vedere chimic precursorul de biosinteză a genei de programare a insulinei sau a două gene, programând separat biosinteza lanțurilor de insulină A și B.

Următoarea etapă este includerea genei pentru precursorul de insulină (sau genele lanțului separat) în genomul E. coli, o tulpină specială de E. coli cultivată în condiții de laborator. Această sarcină este realizată de ingineria genetică.

Plasmida este izolată din E. coli de către enzima de restricție corespunzătoare. Gena sintetică este inserată într-o plasmidă (clonarea cu partea C-terminală funcțională activă a p-galactozidazei E. coli). Ca rezultat, E. coli dobândește capacitatea de a sintetiza un lanț proteic constând din galactozidază și insulină. Polipeptidele sintetizate sunt clivate chimic din enzimă și apoi sunt purificate. În bacterii, aproximativ 100.000 de molecule de insulină sunt sintetizate pe celula bacteriană.

Natura substanței hormonale produsă de E. coli este determinată de introducerea genei în genomul organismului unicelular. Dacă gena precursor de insulină este clonată, bacteria sintetizează precursorul de insulină, care este supus apoi tratamentului cu enzime de restricție pentru a îndepărta preprietatea prin izolarea peptidei C, rezultând insulină biologică activă.

Pentru obținerea insulinei umane purificate, proteina hibridă izolată din biomasă este supusă transformării chimice-enzimatice și purificării cromatografice corespunzătoare (schimb primar, schimbător de anioni care penetrează gelul).

Insulina recombinantă a fost obținută la Institutul de RAS utilizând tulpini E.coli fabricate genetic. Un precursor, o proteină hibridă exprimată în cantitate de 40% din proteina celulară totală, care conține preproinsulină, este eliberată din biomasa cultivată. Transformarea sa în insulină in vitro are loc în aceeași secvență ca și in vivo - polipeptida lider este scindată, preproinsulina este transformată în insulină prin etapele de sulfitoliză oxidativă, urmată de închiderea reductivă a trei legături disulfidice și izolarea enzimatică a legării peptidei C. După o serie de purificări cromatografice, incluzând schimb de ioni, gel și HPLC, se obține insulină umană de înaltă puritate și activitate naturală.

Se poate utiliza o tulpină cu o secvență nucleotidică încorporată în plasmă care exprimă o proteină de fuziune, care constă din proinsulină liniară și fragmentul A de proteină Staphylococcus aureus atașat la capătul său N-terminal.

Cultivarea biomasei saturate a celulelor din tulpina recombinantă asigură începerea producției de proteină hibridă, izolarea și transformarea secvențială a acesteia în tub duce la insulină.

O altă modalitate este, de asemenea, posibilă: într-un sistem de expresie bacteriană se evidențiază o proteină recombinantă de fuziune constând din proinsulină umană și o coadă de polistidină atașată de ea printr-un rest de metionină. Se izolează folosind cromatografia de chelat pe coloane de Ni-agaroză din corpurile de incluziune și se digeră cu bromură de cian.

Proteina izolată este S-sulfonată. Analiza de cartografiere și spectrometrie de masă a proinsulinei obținute, purificată prin cromatografie cu schimb de ioni pe schimbător de anioni și RP (în fază inversă) HPLC (cromatografie lichidă de înaltă performanță), prezintă prezența podurilor disulfidice corespunzătoare punților disulfurice ale proinsulinei umane native.

Recent, sa acordat o atenție deosebită simplificării procedurii de producere a insulinei recombinante prin metode de inginerie genetică. De exemplu, este posibil să se obțină o proteină de fuziune constând din peptida lider a interleukinei 2 atașată la capătul N-terminal al proinsulinei prin intermediul unui reziduu de lizină. Proteina este exprimată în mod eficient și localizată în corpurile de incluziune. După izolare, proteina este scindată cu tripsină pentru a produce insulină și peptidă C.

Insulina și peptida C rezultată au fost purificate prin RP HPLC. Atunci când se creează structuri de fuziune, raportul de masă dintre proteina purtătoare și polipeptida țintă este foarte semnificativ. C-peptidele sunt conectate prin principiul capului-coadă folosind distanții de aminoacizi care poartă situsul de restricție SfiI și două resturi de arginină la începutul și la sfârșitul distanțierului pentru scindarea ulterioară a proteinei cu tripsină. Produsele de clivare HPLC arată că scindarea peptidei C este cantitativă și acest lucru face posibilă utilizarea metodei genelor sintetice multimerice pentru a obține polipeptide țintă la scară industrială.

Diabetul zaharat este o boală cronică cauzată de o deficiență insulinică absolută sau relativă. Aceasta se caracterizează printr-o tulburare metabolică profundă a carbohidraților cu hiperglicemie și glucozurie, precum și alte tulburări metabolice ca urmare a unui număr de factori genetici și externi.

Insulina până în prezent servește ca un radical și, în cele mai multe cazuri, singura modalitate de a menține viața și dizabilitatea persoanelor cu diabet zaharat. Înainte de primirea și introducerea de insulină la clinică în 1922-1923. Pacienții cu diabet zaharat de tip I au așteptat un rezultat letal timp de unu până la doi ani de la debutul bolii, în ciuda utilizării celor mai slabe diete. Pacienții cu diabet zaharat tip I au nevoie de terapie de substituție pe toată durata vieții cu insulină. Terminarea din diferite motive pentru introducerea regulată a insulinei duce la dezvoltarea rapidă a complicațiilor și la decesul iminent al pacientului.

În prezent, diabetul în ceea ce privește prevalența se află pe locul 3 după bolile cardiovasculare și oncologice. Potrivit Organizației Mondiale a Sănătății, prevalența diabetului în rândul populației adulte în majoritatea regiunilor lumii este de 2-5% și există o tendință de creștere a numărului de pacienți de aproape două ori la fiecare 15 ani. În ciuda progreselor evidente în domeniul sănătății, numărul pacienților dependenți de insulină crește în fiecare an, iar în prezent în Rusia doar 2 milioane de persoane.

Crearea de medicamente de insulină genetică umană umană deschide noi posibilități pentru rezolvarea multor probleme de diabetologie din Rusia pentru a salva viețile a milioane de oameni cu diabet zaharat.

Biotehnologie: Manual pentru licee / Ed. NS Egorova, V.D. Samuilova.- M.: Școala superioară, 1987, pp. 15-25.

Ingineria umană de inginerie genetică. Îmbunătățirea eficienței separării cromatografice folosind principiul bifuncționalității. / Romanchikov, A.B., Yakimov, S.A., Klyushnichenko, V.E., Arutunyan, A.M., Vulfson, A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997-23, No. 2

Glick B., Pasternak J. Biotehnologie moleculară. Principii și aplicare. M.: Mir, 2002.

Egorov N. S., Samuilov V. D. Metode moderne de creare a tulpinilor industriale de microorganisme // Biotehnologie. Voi. 2. M.: Școala superioară, 1988. 208 p.

Imobilizarea tripsinei și carboxipeptidazei B pe silice modificată și utilizarea lor în conversia proinsulinei umane recombinante la insulină. / Kudryavtseva N.E., Zhigis L.S., Zubov V.P., Vulfson A.I., Maltsev K.V., Rumsh L.D. // Produse farmaceutice chimice. J., 1995-29, Nr. 1, pp. 61-64.

Biologie moleculară. Structura și funcția proteinelor. / Stepanov V. M. / / Moscova, Liceul, 1996.

Elementele de bază ale biotehnologiei farmaceutice: Ghid de studiu / ETC. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov-pe-Don: Phoenix; Tomsk: Editura NTL, 2006.

Sinteza fragmentelor de insulină și studiul proprietăților lor fizico-chimice și imunologice. / Panin L.E., Tuzikov F.V., Poteryaeva ON, Maksyutov A.Z., Tuzikova N.A., Sabirov A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997-23, No. 12, pp. 953-960.

Regulamentele pentru producerea de insulină cu metode modificate genetic

Acasă> Prezentare> Medicină, Sănătate

Instituția de învățământ de stat

învățământul profesional superior

Universitatea de Stat din Kursk

Agenția Federală pentru Sănătate și Dezvoltare Socială

Departamentul de Tehnologie Farmaceutică

pentru a obține insulină modificată genetic utilizând biotehnologia ADNc

Al 5-lea student la 5 grupuri

Ph.D., profesor principal Maravina I.N.

Secțiunea I. Caracteristicile produsului final 3

Secțiunea II. Caracteristicile materiilor prime 5

Secțiunea III. Schema de producție chimică 6

Secțiunea IV. Schema tehnologică de producție 7

Secțiunea V. Graficul producției și specificațiile

Secțiunea VI. Declarația procesului 10

Secțiunea VII. Metode de analiză 14

Secțiunea VIII. Siguranță, siguranță la foc,

salubritate industrială 16

Secțiunea IX. Lista instrucțiunilor de producție 17

Secțiunea I. Caracteristicile produsului final

Biomasa de insulină uscată

Descriere. Soluțiile de insulină sunt lichide acide limpezi, incolore sau ușor gălbui (pH 2,0-3,5), care se prepară prin diluarea insulinei cristaline în apă acidificată cu acid clorhidric, cu adăugare de glicerol și 0,25-0,30% soluție de fenol sau tricrezol pentru conservare.

Agent hipoglicemic, insulină cu acțiune scurtă. Interacționează cu un receptor specific în membrana exterioară a celulelor și formează un complex receptor-insulină. Prin activarea biosintezei cAMP în celulele grase și celulele hepatice sau în celulele musculare direct penetrabile, complexul receptor-insulină stimulează procesele intracelulare, incluzând sinteza unui număr de enzime cheie (hexokinază, piruvat kinaza, glicogen sintetază, etc.). Scăderea glicemiei se datorează creșterii transportului intracelular, creșterea absorbției și absorbției prin țesuturi, stimularea lipogenezei, glicogenogenezei, sintezei proteinelor, scăderea ratei de producție a glucozei de către ficat etc. Durata acțiunii preparatelor de insulină se datorează în principal absorbției factori (de la o doză, o metodă și un loc de injectare). După p / la începutul efectului - după 0,5 h, efectul maxim - după 1-3 ore, durata acțiunii - 8 ore.

Diabet zaharat de tip 1 (dependent de insulină). Diabet zaharat de tip 2 (non-dependent de insulină): stadiu de rezistență la medicamentele hipoglicemiante orale, rezistență parțială la aceste medicamente (în timpul terapiei combinate), afecțiuni intermediare, sarcină.

La începutul terapiei - afectarea vizuală, umflarea membrelor. Odată cu introducerea unor doze prea mari de insulină sau a unei încălcări a dietei (sărind peste mese), precum și exerciții excesive, hipoglicemia (transpirația rece, pielea palidă, nervozitatea, tremorul, anxietatea, oboseala excesivă sau slăbiciunea, dezorientarea, dureri de cap, senzație pronunțată de foame, tulburări vizuale temporare, greață, tahicardie, în cazuri grave - pierderea conștiinței, comă). Reacții alergice sistemice: transpirație crescută, vărsături, dificultăți de respirație, palpitații, amețeli.

Perioada de valabilitate - 1 an de la data fabricației.

Secțiunea II. Caracteristicile materiilor prime

Lanțurile genelor care codifică sinteza lanțurilor A și B

Sintetizate chimic

Cultura trebuie să fie curată

Pungi de hârtie cu patru straturi

Țesături din bumbac

Secțiunea III. Schema de producție chimică

Nu există transformări chimice în producerea de insulină modificată genetic.

Secțiunea IV Schema tehnologică pentru producerea de insulină

Pregătirea spațiilor și a echipamentelor

Producția de prelucrare sanitară

Pregătirea echipamentului tehnologic

Sinteza lanțurilor A și B

Introducerea genelor în plasmidă

Introducerea ADN r în celula permisivă

Pregătirea nutrienților

Cultura culturii suspensiei

Obținerea moleculei de insulină

Conform indicatorilor FS

Instrument de producție și specificația echipamentului

1 - Reactor chimic

2 - Introducerea de gene în plasmidă

4 - Unitate de sterilizare continuă

5 - Bioreactor industrial

6 - Selectarea lanțurilor

7 - Instalare cromatografică

8 - obținerea moleculei de insulină

9 - Uscător prin congelare

10 - Masă analitică

Secțiunea VI. Descrierea procesului

BP 1. Pregătirea apei

Membranele de distilare sunt proiectate pentru a obține apa desalinizată care îndeplinește cerințele GOST 6709-97 "Apă distilată". Productivitatea distilatorilor - de la 3 la 15 l / oră (instalații de laborator într-un set complet economic) și, de asemenea, de la 5-30 l / h (instalații de laborator). Procesul de filtrare include următoarele etape: tratarea prealabilă a carbonului activat, filtrarea cu membrană și deionizarea apei folosind rășini schimbătoare de ioni. Pre-filtrul îndepărtează particulele suspendate, clorul, materia organică înaltă și ionii de metale grele de la apa de la robinet. Filtrarea prin membrană se bazează pe fenomenul de osmoză inversă, în care apa, atunci când trece printr-o membrană semipermeabilă, este purificată din săruri dizolvate în ea, impurități organice cu greutate moleculară mică, precum și bacterii și microorganisme. Pe filtrul cu rășini schimbătoare de ioni se efectuează o purificare completă a filtratului din săruri dizolvate.

BP 2. Prelucrarea sanitară a producției.

BP 2.1. Următoarele cerințe sunt plasate în incintă pentru fabricarea formelor de dozare sterile:

Trebuie să fie păstrate în condiții de igienă impecabilă, supuse curățării zilnice, precum și curățenie generală și reparații periodice;

Poate fi expus la radiații UV pentru dezinfecția aerului prin iradiere staționară sau portabilă;

Trebuie să aibă iluminat, temperatură, umiditate și ventilație care nu au un impact negativ direct sau indirect asupra calității produselor finite;

Trebuie să conțină cantitatea minimă de echipamente și mobilier necesare desfășurării procesului de producție;

Îmbinarea dintre pereți, podea și tavan trebuie să aibă o formă rotunjită;

În clasele I și II de curățenie nu ar trebui să existe comunicări deschise, conducte de aer;

Premisele unei clase mai înalte de curățenie ar trebui amplasate într-o încăpere cu o clasă inferioară de curățenie. Accesul personalului și al materiilor prime într-o cameră curată se realizează numai prin intermediul unor gateway-uri de aer, care sunt furnizate cu alimentare cu aer steril conform schemei "de sus în jos";

Transferul produsului finit trebuie efectuat cu ajutorul unui transportor care trece prin pereți.

BP 2.2. Pregătirea echipamentelor

Cerințe pentru pregătirea echipamentului:

Echipamentul trebuie să fie proiectat și amplasat astfel încât funcționarea, întreținerea și reparațiile acestuia să poată fi efectuate în afara spațiilor "curate";

Echipamentele utilizate pentru a lucra în condiții aseptice trebuie să aibă dispozitive de înregistrare pentru monitorizarea parametrilor procesului și prezența dispozitivelor de alarmă pentru funcționarea defectuoasă;

Echipamentul trebuie curățat, dezinfectat și, dacă este necesar, sterilizat;

Echipamentul trebuie monitorizat pentru o puritate microbiologică;

Suprafața de lucru a echipamentului trebuie să fie netedă, din materiale netoxice și necorozive.

BP 2.3. Instruirea personalului

Cerințe pentru personal:

Personalul trebuie să aibă o anumită cunoaștere minimă a normelor privind igiena, igienizarea și BPF;

Angajații cu boli infecțioase, răni deschise pe piele și purtători ai microflorei patogene nu au voie să lucreze;

Este interzis să vorbiți, să mâncați alimente, să vă mutați rapid la locul de muncă;

Respectați cu strictețe igiena personală, îndepărtați cosmeticele de pe față și îndepărtați bijuteriile înainte de a intra în camera "curată";

Luați un duș, spălați-vă și curățați-vă mâinile cu dezinfectanți, puneți-vă un set de îmbrăcăminte și încălțăminte tehnologice sterile.

BP 3. Sinteza lanțurilor A și B.

Sinteza lanțurilor se efectuează printr-o metodă chimică. Lanțul A conține 21 de resturi de aminoacizi, resturi de lanț B - 30

BP 4. Introducerea genelor în plasmidă.

Pentru ca plasmida să accepte o genă străină, lanțul său este tăiat cu enzime de restricție. Pentru legarea genelor care codifică sinteza lanțurilor A și B, se utilizează reziduuri de oligozaharide de diferite lungimi - linkere și adaptoare. Când molecula este închisă, o puteți introduce într-o celulă permisivă.

BP 5. Introducerea ADN r în celula permisivă.

Introducerea p = ADN într-o celulă E. coli se efectuează prin microinjecție: o plasmidă care conține ADN vector este injectată într-o celulă E. coli cu un ac special din sticlă ultrathin.

TP 6. Prepararea mediului nutritiv

Principalul mediu nutritiv pentru cultivarea culturii E. coli este supa conform lui Miller. Ingrediente: hidrolizat de cazeină, extract de drojdie, clorură de sodiu, agar-agar. Valoarea finală a pH-ului (la 25 ° C) este de 7,0 ± 0,2. Se utilizează, de asemenea, bulionul Hottinger. Ingrediente: hidrolizat Hottinger, clorură de sodiu, apă distilată.

Sterilizarea mediului nutritiv se realizează într-o mașină de sterilizare continuă - ONS. Mediul nutritiv trece succesiv prin secțiunea de încălzire, secțiunea de susținere și secțiunea de răcire.

TP 7. Cultivarea culturii suspensiei

Cultivarea cu biocultură se realizează în bioreactoare, în cultură de suspensie în care se amestecă datorită furnizării aerului în bioreactor. Procesul se efectuează în mod semi-periodic, când o anumită cantitate de mediu nutritiv proaspăt este adăugată în mod constant la bioretator și, în același timp, este luat același volum de suspensie celulară.

TP 8. Izolarea culturii tisulare.

Separarea culturii de țesuturi de mediul nutritiv se efectuează prin metoda sedimentării (sedimentare) în sedimenteri, o separare mai profundă fiind oferită prin filtrarea unei metode delicate pentru a păstra integritatea celulelor de cultură.

Insulina este purificată prin metode de cromatografie: permeație frontală, gel, schimb de anioni. Purificarea insulinei și a derivaților săi pe sorbenți cu proprietăți puternice de schimb de cationi (de exemplu, SP-Sepharose FF) pot fi utilizate sisteme tampon pe bază de acetat de amoniu cu un conținut scăzut de uree (până la 2 M sau mai puțin).

TP 10. Obținerea moleculei de insulină

Lanțurile selectate și purificate sunt pliate și oxidate, ceea ce asigură formarea punților disulfurice corespunzătoare.

Uscarea produsului se efectuează într-un uscător cu congelare.

TP 12. Evaluarea calității produsului finit.

Aspect (după cum este descris), activitate (metodă biologică).

UMO 13. Ambalare, etichetare, expediere.

Activitatea insulinei este măsurată în unități de acțiune (ED) sau în unități internaționale de acțiune (UI - rusă sau UI - engleză sau UI - franceză). 1 unitate corespunde activității de 1/24 mg (41,66 μg) de insulină cristalină.

În 1922, Frederick Banting a sugerat că unitatea de acțiune pentru insulină trebuie considerată ca numărul de centimetri cubi de extract pancreatic care, în 2-4 ore, a adus un iepure sănătos la hipoglicemie cu un nivel de SC de 2,5 mmol / L Puțin mai târziu în același an, aceeași echipă a propus o unitate "de șoarece" - cantitatea de insulină necesară pentru a aduce jumătate din grupul experimental de șoareci la convulsii (cercetătorii acționau inițial prin analogie cu LD50).

În anul următor, Comitetul Internațional de Standardizare a adoptat definiția unității de acțiune pentru insulină: "Cantitatea de insulină necesară pentru a scădea nivelul glucozei din sânge la nivelul la care încep crizele la iepurii cu greutatea de 2 kg, care nu au fost hrăniți timp de 24 de ore". Această unitate, în onoarea Grupului Toronto de Banting and Best, a fost numită unitatea de acțiune de insulină din Toronto.

În 1925, a fost introdus primul standard internațional, care a stabilit că o unitate de acțiune cu insulină este o cantitate echivalentă cu 1/8 mg insulină cristalină.

Datorită progresului major în purificarea insulinei și a inconvenientelor de a folosi o unitate atât de mare în 1936, comisia Ligii Națiunilor a aprobat un nou standard internațional pentru acțiunea insulinei, care a echivalat unitatea cu 1/22 mg insulină cristalină. În 1952, standardul a fost din nou schimbat și 1 unitate a fost echivalentă cu 1 / 24,5 mg de insulină cristalină, iar în 1958 a apărut cel de-al patrulea standard (1 U este egal cu 1/24 mg de insulină cristalină). În 1982, OMS a făcut cele mai recente adaptări ale standardului, care nu au afectat definiția unității, ci au vizat numai modificările asociate cu apariția insulinei umane modificate genetic.

Secțiunea VIII. Siguranță, siguranță la foc și

Fiecare lucrător și lucrător tehnic la primirea lucrării trebuie să urmeze o instruire primară. Pregatirea primara este efectuata de maistru sau maestru conform urmatorului program:

Principalele prevederi ale legislației privind protecția muncii, siguranță, salubrizare industrială;

Scopul și procedura de utilizare a îmbrăcămintei speciale și a echipamentului individual de protecție;

Atribuții la locul de muncă;

Cerințe pentru organizarea și întreținerea corespunzătoare a locului de muncă;

Normele generale de siguranță electrică, valoarea ventilației și regulile de utilizare a sistemelor de ventilație;

Cunoașterea procesului tehnologic, a echipamentelor și a tuturor obiectelor periculoase.

Toate echipamentele electrice trebuie să respecte cerințele din "Regulile de funcționare a echipamentelor electrice". Echipamentul electric trebuie să fie legat la pământ. Toate sălile de producție și utilități, instalațiile, facilitățile ar trebui să fie prevăzute cu echipament de stingere a incendiilor și echipament de stingere a incendiilor.

Admiterea persoanelor neautorizate în magazin este interzisă.

Secțiunea IX. Lista instrucțiunilor de producție

Instrucțiuni de lucru pentru tratarea igienică a încăperilor.

Instrucțiuni pentru siguranță, salubritate industrială și siguranță la incendiu.

Instrucțiuni privind pregătirea, livrarea și primirea reparării echipamentelor.

Instrucțiuni privind modul de primire a materiilor prime și a materialelor auxiliare;

Planul de eliminare a accidentelor.

Instrucțiuni pentru regenerarea soluției.

Instrucțiuni de lucru pentru operatorul de spălare, uscare și sterilizare.

Instrucțiuni pentru mecanici pentru repararea și întreținerea conductelor.

Tehnologia de producere a insulinei

INSULIN.docx

Capitolul 1. Revizuirea literară

1.3. Seringi, pixuri și distribuitoare de insulină

1.4 Tehnica de injectare a insulinei.............................................

1.5.Factorii care afectează absorbția și acțiunea insulinei.........

1.6. Complicațiile terapiei cu insulină............................................

1.7. Insulina

1.8. Stocarea insulinei.

1.9. Moduri moderne de îmbunătățire a terapiei cu insulină.....

Capitolul 2. Partea experimentală

Insulina (din insula latină, insulă) - un hormon peptidic, se formează în celulele beta ale insulelor Langerhans ale pancreasului. Ea are un efect multilateral asupra metabolismului în aproape toate țesuturile.

Numărul persoanelor cu diabet zaharat din întreaga lume este de 120 de milioane (2,5% din populație). La fiecare 10-15 ani numărul de pacienți se dublează. Potrivit Institutului Internațional de Diabet (Australia), până în 2010 vor exista 220 de milioane de pacienți în lume. În Ucraina există aproximativ 1 milion de pacienți, dintre care 10-15% suferă de cel mai sever diabet zaharat dependent de insulină (tipul I). De fapt, numărul de pacienți este de 2-3 ori mai mare datorită formelor nediagnosticate ascunse.

În 1935, cercetătorul danez Hagedorn a optimizat acțiunea insulinei în organism prin propunerea unui medicament prelungit.

Scopul lucrării mele: Studiul preparatelor de insulină prezentate pe piața noastră, avantajele și dezavantajele acestora.

Sarcini: Examinarea procesului de obținere a insulinei în producția industrială.

Capitolul 1. Revizuirea literară

1.1 Obținerea de insulină

Insulina umană poate fi produsă în patru moduri:

1) sinteza chimică completă;

3) printr-o metodă semisintetică utilizând o substituție chimică enzimatică la poziția 30 a catenei B a alaninei aminoacide în insulina de porc cu treonină;

4) metoda biosintetică pentru tehnologia ingineriei genetice. Ultimele două metode permit obținerea de insulină umană de înaltă puritate.

Luați în considerare obținerea de insulină biosintetic, în ceea ce privește avantajele acestei metode.

Deci, beneficiile obținerii biosintetic a insulinei.

Înainte de introducerea metodei de producere a insulinei utilizând microorganisme recombinante în industrie, a existat o singură cale de obținere a insulinei - din glandele pancreatice ale bovinelor și porcilor. Insulina derivată din pancreasul bovinelor diferă de insulina umană cu 3 reziduuri de aminoacizi, iar insulina obținută din glanda porcină este doar un reziduu de aminoacizi, adică este mai aproape de insulina umană. Cu toate acestea, cu introducerea de proteine care diferă în structura de proteine umane, chiar și într-o astfel de expresie minoră, pot apărea reacții alergice. O astfel de insulină ca proteină străină poate fi, de asemenea, inactivată în sânge de anticorpii care rezultă.

În plus, pentru a obține un kilogram de insulină, sunt necesare 35 mii de porci (dacă se știe că nevoia anuală de insulină este de 1 tonă de medicament). Pe de altă parte, aceeași cantitate de insulină poate fi obținută biosintetic prin biosinteză într-un fermentator de 25 cubi, folosind microorganismul recombinant Escherichia coli.

Metoda biosintetică de obținere a insulinei a fost aplicată la începutul anilor 80

Să ne concentram asupra schemei de producere a insulinei recombinante (Eli Lilli-Eli-Lilly, Statele Unite ale Americii):

Etapa 1. Prin sinteza chimică s-au creat secvențe nucleotidice care codifică formarea lanțurilor A și B, adică genele sintetice au fost create.

Etapa a doua. Fiecare dintre genele sintetice este introdusă într-o plasmidă (o lanț de sinteză a genei este introdusă într-o plasmidă și o lanț de sinteză a genei B este introdusă în cealaltă plasmidă).

Etapa 3. Introduceți gena care codifică formarea enzimei betagalactozidază. Această genă este inclusă în fiecare plasmidă pentru a realiza replicarea viguroasă a plasmidelor.

Etapa a 4-a. Plasmidele se introduc în celula Escherichia coli - Escherichia coli și se obțin două culturi de producție, o cultură sintetizează lanțul A, al doilea lanț B.

Etapa 5. Așezați două culturi într-un fermentator. Miercuri, adăugați galactoză, care induce formarea enzimei betagalactozidază. În acest caz, plasmidele repetă activ, formând multe copii ale plasmidelor și, prin urmare, multe gene care sintetizează lanțurile A și B.

Etapa 6. Celulele lizează, secretă lanțurile A și B, care sunt asociate cu betagalactozidaza. Toate acestea sunt tratate cu bromură de cianogen și lanțurile A și B sunt scindate din beta-galactozidază. Apoi efectuați o purificare suplimentară și selectarea lanțurilor A și B.

Etapa 7. Resturile de cisteină se oxidează, se leagă și se prepară insulină.

Insulina obținută pe această cale este insulina umană în structura ei, care de la începutul terapiei minimizează apariția reacțiilor alergice.

Pentru obținerea insulinei umane purificate, proteina hibridă izolată din biomasă este supusă transformării chimice-enzimatice și purificării cromatografice adecvate (schimb frontal, gel-penetrant, anion-schimb).

O insulină recombinantă a fost obținută la Institutul Academiei de Științe din Rusia, folosind tulpini de E. coli cu tehnică genetică, metoda constând în sinteza precursorului său biologic de proinsulină, ceea ce face posibil să nu se efectueze sinteza separată a lanțurilor de insulină A și B. Pentru producerea părții pro-insulină a moleculei în E. coli. plasmidul este introdus (se obține prin inserarea ADN-ului natural sau străin - așa se obține o moleculă ARN recombinantă). Plasmida asigură sinteza proteinei recombinante, care este o secvență lider și un fragment al proteinei, precum și proinsulină umană cu rest de metionină (aminoacid) între ele. Partea pro-insulină a moleculei este separată prin tratarea cu cian brom în acid acetic (scindarea este efectuată selectiv - de restul de metionină). Amestecul (partea de proinsulină și secvența lider) este separată prin cromatografie. În etapa următoare, în secvența rezultată de proinsulină, se efectuează aranjamentul reciproc corect al lanțurilor A și B, care se efectuează de partea centrală - peptida C. în etapa următoare, peptida C de legare este izolată printr-o metodă enzimatică. După o serie de purificări cromatografice, inclusiv schimbul de ioni, gel și HPLC, obțin insulină umană de înaltă puritate și activitate naturală.

Controlul calității insulinei modificate genetic implică controlul indicatorilor suplimentari care caracterizează stabilitatea tulpinii și plasmidei recombinante, absența materialului genetic exogen în preparat, identitatea genei exprimate etc.

1.2 Preparate cu insulină

Preparatele de insulină umană pentru structura chimică sunt complet identice cu insulina umană.

Preparatele de insulină, în funcție de debutul și durata acțiunii, sunt împărțite în următoarele grupuri:
1) insuline de acțiune rapidă și ultrascurtă;
2) insuline cu acțiune scurtă (insuline "simple");
3) insuline cu durată medie (insuline "intermediare");
4) insuline cu acțiune lungă;
5) insuline "amestecate" - o combinație de insuline cu durată diferită de acțiune.

Numărul de preparate pe bază de insulină cu diferite denumiri este mai mare de zeci și sunt adăugate în fiecare an noi denumiri de insulină din diferite țări străine, iar în ultimii ani, companii farmaceutice naționale.

Insuline rapide și ultrascurte

Insulinele rapide și ultrascurte includ în prezent trei medicamente noi - lispro (humalog), aspart (novoid, novolog) și glulissin (apidra). Particularitatea lor este în începerea și sfârșitul mai rapid al acțiunii în comparație cu insulina obișnuită, "simplă". Debutul rapid al efectului de scădere a glicemiei al insulinelor noi se datorează absorbției accelerate a acestora de către grăsimile subcutanate. Particularitățile noilor insuline fac posibilă reducerea timpului dintre injecțiile lor și consumul de alimente, reducerea nivelului de glicemie post-nutrițională și reducerea incidenței hipoglicemiei.

Debutul acțiunii lizpro, aspart și glulizin este în intervalul de la 5 la 10-15 minute, efectul maxim (acțiune maximă) - după 60 de minute, durata acțiunii - 3 - 5 ore. Aceste insuline se administrează cu 5 până la 15 minute înainte de masă sau imediat înaintea acesteia. S-a stabilit că administrarea insulinei lispro imediat după masă oferă, de asemenea, un control glicemic bun. Cu toate acestea, este important să rețineți că administrarea acestor insuline cu 20 până la 30 de minute înainte de masă poate duce la hipoglicemie.

Pacienții care trec la introducerea acestor insuline trebuie să controleze mai des nivelurile glicemice până când învață să coreleze cantitatea de carbohidrați consumată și doza de insulină. Astfel, dozele de medicamente sunt stabilite în fiecare caz individual.

Dacă se utilizează numai insulină lispro, un nou rapid sau un novice (insulină aspart) sau apidra (insulină glulizină), acestea pot fi administrate de 4-6 ori pe zi și în asociere cu insuline cu acțiune lungă de 3 ori pe zi. Este permisă o doză unică de 40 U în cazuri excepționale. Aceste insuline, disponibile în flacoane, pot fi amestecate în aceeași seringă cu preparate de insulină umană cu o durată mai lungă de acțiune. Când această insulină de mare viteză este colectată mai întâi în seringă. Injecția este de dorit să se facă imediat după amestecare. Aceste insuline produse în cartușe (mâneci speciale) nu sunt destinate preparării amestecurilor cu orice altă insulină.

Acest lucru este important!
Noi insuline de mare viteză sunt convenabile pentru pacienții care duc un stil de viață activ, utilizarea lor este recomandată pentru infecții acute, stres emoțional, creșterea cantității de carbohidrați din alimente, luarea medicamentelor care promovează hiperglicemia (hormoni tiroidieni, corticosteroizi - prednisolon etc.), cu alte intoleranțe preparate de insulină sau hiperglicemie post-nutritivă, care este slab accesibilă acțiunii altor insuline. Trebuie subliniat încă o dată că insulinele cu acțiune rapidă trebuie utilizate în legătură directă cu administrarea de alimente.

Tehnologia de producere a insulinei

Schema tehnologică

Tipuri de insulină și metode pentru producerea acesteia

Regulamentele pentru producerea de insulină cu metode modificate genetic

Acasă> Prezentare> Medicină, Sănătate

Tehnologia de producere a insulinei

INSULIN.docx

Cititi Mai Multe Despre Diabet

Simptome De Diabet

Indicele Glicemic